MELLENTIN-MICHELOTTI J et al., Determination of ligand binding affinities for endogenous seven-transmembrane receptors using fluorometric microvolume assay technology, Anal Biochem. 1999, v.272, n.2, p.182-90. US 2004058403, 25.03.2004. MAGGIONI A et al., Targeting the expression of functional murine CMP-sialic acid transporter to the E.coli innermembrane., Biochem Biophys Res Commun. Epub 2007. CHEN G et al., Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS), Nat Biotechnol. 2001, v.19, 6, p.537-42. ROMANOV GA et al., A live cell hormone-binding assay on transgenic bacteria expressing a eukaryotic receptor protein., Anal Biochem. 2005, v.347, 1, p.129-34. HARVEY BR et al., Anchored periplasmic expression, a versatile technology for the isolation of high-affinity antibodies from Escherichia coli-expressed libraries, Proc Nat1 Acad Sci USA. 2004, v.101, 25, p.9193-8. JUNG ST et al., Binding and enrichment of Escherichia coli spheroplasts expressing inner membrane tethered scFv antibodies on surface immobilized antigens, Biotechnol Bioeng. 2007, v.98, 1, p.39-47. LEGROS С et al., Generating a high affinity scorpion toxin receptor in KcsA-Kvl.3 chimeric potassium channels, J Biol Chem. 2000, v.275, 22, p.16918-24. RU 0002306319 C1, 20.09.2007.
Имя заявителя:
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (RU)
Изобретатели:
Некрасова Оксана Васильевна (RU) Феофанов Алексей Валерьевич (RU) Игнатова Анастасия Александровна (RU) Назарова Анна Ивановна (RU) Королькова Юлия Владимировна (RU) Болдырева Елена Филипповна (RU) Чупин Владимир Викторович (RU) Гришин Евгений Васильевич (RU) Арсеньев Александр Сергеевич (RU) Кирпичников Михаил Петрович (RU)
Патентообладатели:
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (RU)
Реферат
Способ относится к области биотехнологии, а именно к способу качественной и количественной оценки связывания мембранного белка с лигандом. Способ включает экспрессию рекомбинантного мембранного белка в клетках E.coli в составе цитоплазматической мембраны. Готовят препарат сферопластов из клеток E.coli путем пермеабилизации клеточной стенки с использованием лизоцима, ЭДТА, MgCl2. Готовят меченый лиганд, вносят сферопласты в лунки планшета, инкубируют сферопласты с меченым лигандом. Детектируют комплекс мембранного белка с лигандом на поверхности сферопластов. Измеряют уровень флуоресценции на поверхности сферопластов методом флуоресцентной микроскопии. Определяют константы диссоциации Kd для комплекса мембранного белка с лигандом. Проводят конкурентное вытеснение флуоресцентно-меченого лиганда немеченым лигандом из комплекса с мембранным белком. Определяют константы IC50 для немеченого лиганда и рассчитывают константы диссоциации Кi для немеченого лиганда. Изобретение позволяет упростить способ и повысить эффективность качественной и количественной оценки связывания мембранного белка с исследуемыми соединениями. 7 ил.
Поиск патентов
Получить полное описание патента